欢迎来到 阿仪网

免费注册

首页 | 产品 | 求购 | 资讯 | 专题 | ?#39029;?#21830; | 打听 | 人才 | 品牌 | 资料 | 技术文献 | 展会 | 耗材 | 配件 | 新品 | 促销 | 书籍 | 招标 | 优质仪器

您的位置: 首页 >技术文献 >行业标准 >远慕生物:Western Blot中的三大常见问题

远慕生物:Western Blot中的三大常见问题

提供者:上海远慕生物科技有限公司   发布时间:2019/9/9  阅读?#38382;?27次   进入该公司展台

Western Blot已经成为实验室中检测蛋白质的常规手段。不过想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片,还是具有?#27426;?#25361;战性的。我们在做蛋白电泳和Western Blot时,多数?#21152;?#30340;Bio-Rad公司的仪器,所以Bio-Rad蛋白方面的技术专家的确可以称之为专家,因为每天?#21152;?#24456;多人向他们请教。他们就将最常见的问题整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我们节选了一部分,希望能帮你节省一些查资料的时间。

Q?#20309;业慕?#26524;是膜上一片空白。为什么会这样?

A:导致这种结果的因素很多。

胶和膜放反了 如果在转印的过程中,胶和膜的位置颠倒了,那么蛋白就从胶?#29486;?#31227;到缓冲液中,而不会到达膜上。对于标准的转印,凝胶应靠近三明治的负极,而膜?#26434;?#27491;极。

转膜效?#23454;?转膜效率受多种因素影响,包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的pH值。一般说来,蛋白越大,转移得越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会穿出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2 um孔径的NC膜或PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值,那么这个蛋白携带的电荷很少,在电场中?#24067;负?#19981;移动。如果你的目的蛋?#36164;?#24378;碱性的,那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。


在转印之后,你可以通过染胶或第二块膜来判?#29486;?#21360;效?#30465;?#20026;了帮助你直接监控转印效率,Bio-Rad也提供了多种预染Marker,它们在电泳以?#30333;?#33180;之后可直接观察到。

试剂放置太?#27809;?#23384;放条件不正确 抗体会慢慢?#21040;猓?#22914;果反复冻融的话,它会快速?#21040;狻?#24213;物应储存在-20°C。

抗体不纯或滴度太低 一抗的浓度差异很大,应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及,太多的抗体也会阻碍抗原与抗体?#24917;岷稀?#19968;般的原则是以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。

酶失活了 叠氮钠是辣根过氧化物酶的?#31181;?#21058;。不要在HRP显色的western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中,而无副作用。另外,自来水或用聚苯乙烯树脂去离子的水也可能会使酶失活,只能使用蒸馏的去离子水。

使用Tween-20洗涤 Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用,或洗走NC膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的?#24352;?#24230;只有0.05%-0.1%,但仍可能会影响结?#31232;?#22240;此除了封闭之后的第一次洗涤,其他洗涤过程中都不使用Tween-20,不过,这可能会使背景升高。

检测?#20302;?#32570;乏足够的灵敏度 确保蛋白的上样量在检测?#20302;?#30340;灵敏?#30830;段?#20869;:
    辣根过氧化物酶          500 pg/band
    碱性磷酸酶                100 pg/band
    增强的碱性磷酸酶           5 pg/band
    胶体金                      100 pg/band
    增强?#24917;?#20307;金               10 pg/band
    Immun-Star 化学发光  10 pg/band

Q:我的western blot总是背景过高,如何解决?

A:背景过高可能是由很多因素引起的:封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度?#27426;?#25110;抗体不纯。

封闭不完全 一抗或二抗只要结合到膜上,就会显色。为了避免非特异性?#24917;岷希?#24212;用封?#25214;?#23413;育膜,使所有的空白位点都被封闭蛋白?#21152;小C膜推荐的封?#25214;?#26159;3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能在4℃孵育,因为它会凝结。如果想要低温封闭的话,可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封?#25214;?#26159;5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景。

显色过度 显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久,背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰可见,而背景?#36127;?#27809;有或很少时,将膜及时取出。
洗涤不充分 在封?#25214;?#21450;抗体孵育之后,至少要洗两?#25991;ぃ?#27599;次5分?#21360;?#21435;污剂的浓度不要太高,否则会把抗原从膜上洗下来。

转移缓冲液或设备污染 使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净。海绵垫也?#27426;?#35201;认真清洗。脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外,每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。

抗体稀释度不正确 一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说,以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。抗体稀释度不够,会产生非特异?#24917;岷希?#24102;来高背景。

二抗不纯 没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用,产生杂带。

Q:在转膜的过程中,缓冲液总是很热,我该怎么办?

A:如果缓冲液过热,它就会分解,产生更多的热量。这可是一个大问题。为了避免分解,?#27426;?#35201;确保你的冷却设?#35813;?#38382;题,使用的是推荐的缓冲?#28023;?#32780;且不在过高的功率下转印。

足够的冷却条件 在大部分情况下,?#21152;?#24403;使用循环冷却水来进行冷却。在冷库中转印,或将转印槽放置在冰浴中都是不行的。因为大部分转印槽都是塑?#29486;?#30340;,不能?#34892;?#22320;散?#21462;?#21478;外,由于胶附近的缓冲?#21644;?#24120;是静止的,在转印过程中应搅动来维持循环。

缓冲液 转印缓冲液的离?#20248;?#24230;必须是已知的,来防止过?#21462;?#22914;果离?#20248;?#24230;过高,电压就应该降低(恒流转印),如果是恒压转印的话,就会过?#21462;?br />
功率条件 转印过程中产生的热是与功率成正比的。我们都知道,功率是电压与电流的乘积。P="IE" 而电压、电流和电阻?#33268;?#36275;这个等式:R="V/I。当缓冲液分解时,电阻下降。如果电压是恒定的,则电流上升。因此,功率上升,产生更多的热量。如果电流是恒定的,则电?#36141;?#21151;率下降,使蛋白转移得更慢。

关键词:生物试剂  远慕生物  

上一篇:【平顶山市房屋安全检测鉴定中心地址】 下一篇:惠州市房屋改造检测鉴定单位哪家专业有?#25163;?今日新闻

优质商品

X射线荧光光谱仪
X射线荧光光谱仪

旗下频道

色谱仪 光谱仪 反应釜 试验箱 试验机 搅拌器 培养箱 离心机 水分测定 气体检测 量热仪 石油仪器 纯水器 比表面仪 温度记录 流量计 万用表 显微镜 粒度仪 测厚仪 硬度计 酸度计 元素分析 生物试剂 电线电缆 天?#33014;?#22120; 传感器 ?#31216;?#26816;测 压力仪表 电化学 测厚仪 阀门仪表 电力仪表 干燥设备 药物检测
英魂之刃熊猫武僧出装
600万彩票网安卓手机版 百人牛牛官方 腾讯彩票游戏正规嘛 捕鱼游戏赢钱的 美女壁纸背影图片 2019时时彩20分钟开奖 南昌按摩会所上班时间列表 北京pk10计划免费 河北时时推荐号码 三个骰子大小开点规律