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大规模细胞培养在抗体生产中的应用-贝克曼库尔特生命科学

提供者:贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司   发布时间:2019/7/18  阅读次数:61次   进入该公司展台

细胞培养技术经过一个多世纪的完善与发展,现已相当成熟,并逐渐走向多样化、自动化和规模化。现如今的抗体圈如火如荼,大规模细胞培养技术被广泛应用并决定着抗体行业的发展,其中以CHO细胞培养表达单克隆抗体的生产最为关注,也是目前抗体领域研究的重点和热点。


 

回望整个细胞培养工艺,从培养瓶到大规模细胞培养,无论是细胞培养密度,还是抗体表达水平?#21152;?#20102;极大的提高,大规模细胞培养下细胞密度可达1~2×107cell/mL,抗体表达量高达3~5g/L,培养体积更可达到20000L的规模。这些技术水平的飞速提升,既源于上游细胞系构建技术的突破,也得益于细胞大规模培养工艺的日臻成熟。尤其是后者综合培养基开发,工艺优化,结合新型生物反应器的使用,实现了动物细胞的高密度、高表达培养,满足了临?#37319;?#23545;于抗体药物“公斤级”产能的需求。


 

作为单克隆抗体细胞系研究的热点,CHO细胞培养生产工艺有以下三方面的要求:

首先,通过CHO细胞培养能够表达出?#32454;?#30340;单克隆抗体;

其次,CHO细胞培养工艺要能稳定表达出?#32454;?#30340;单克隆抗体;

最后,CHO细胞培养工艺要实?#25351;?#25928;率和高经济效益的生产单克隆抗体。


 

而在其大规模细胞培养工艺中,关键的影响因素主要体现在以?#24405;?#20010;方面:培养基,生物反应器的物理参数,工艺参数对表达抗体质量的影响等,这几点共同影响抗体生产的最终质量。
 

 

培养基

 

根据在细胞培养过程中加入时间和目的的不同,培养基通常分为基础培养基和补料培养基。基础培养基主要是细胞培养的初期用于细胞的繁殖和生长阶段,而补料培养基可以用于细胞繁殖的早期和代谢产物的表达阶段。


 

近年来,随着生物医药研究?#27426;?#28145;入和发展,哺乳动物细胞无血清培养技术已成为引人关注的热点和难点问题。与传统的有血清细胞培养相比,它具有安全性好、过程便于监测、技术稳定可靠、工艺放大容易等众多优点,最大规模可达到25,000 L,为众多生物制药同行所青睐。


 

在CHO细胞培养表达工?#23637;?#31243;中,对培养基的优化是提高表达抗体产品产率和质量的重要工艺手段之一。主要的优化方式有3种:

(1)选用多种商品类培养基进行组合混料实验,根据CHO细胞培养的情况来选出较好的组合混料培养基。

(2)选用固定的培养基并向其中添加微量元素、?#34987;?#37240;、生物因子及维生素等物质,通过培养实验结果得出对CHO细胞培养影响最大的物质,然后再有针对性地进行培养基的优化处理。

(3)根据CHO细胞的情况来分析CHO细胞生长繁殖过程中和代谢表达过程中所需的营养物质和限制因子,然后进行针对性的添加或去除,从而达到优化培养基的目的。


 

近年来,CHO 细胞培养的培养基已开发多种,有商品类和定制类可以满足CHO细胞培养的物质营养和代谢表达需求。相比于商品类的CHO细胞培养基,定制类培养基可以根据具体CHO 细胞株的特性进行针对性的配制和优化,以实现CHO细胞培养表达产品产率和质量的提高,同时还有利于对培养基进行优化处理。


 

 

2
生物反应器的物理参数

 

在大规模细胞培养工艺中反应器参数的设定?#24067;?#20026;重要,每一项参数?#21152;?#21709;着整个细胞培养全过程,培养温度,pH值,DO溶氧,CO2的适时调整,培养基的营养成分,例如葡萄糖、谷氨酰胺、?#34987;?#37240;、维生素等的消?#27169;?#20197;及自身代谢产物,例如乳酸、氨、重组蛋白等的积累与生理生化参数(细胞密度、活性,能荷等)的变化等。作为大规模细胞培养上述过程参数的改变会直接影响生产的细胞系活性与表达抗体的收率及质量。

 

在CHO细胞培养表达工?#23637;?#31243;中,对培养的温度、培养环境的酸碱度及环境的溶氧情况等参数?#21152;幸欢?#30340;要求,通过对培养参数的研究来确定CHO细胞大规模培养表达单克隆抗体工艺的最佳培养参数。


 

目前,在CHO细胞培养中变温培养应用最为广泛,在CHO细胞的生长繁殖阶段和代谢产物表达阶段的温度控制在不同的?#27573;?#20869;,在繁殖的后期阶段将温度降低以延缓CHO细胞的死亡来提高代谢产物的表达量。与此同时,在CHO 细胞培养过程中对于培养环境酸碱度的把控也影响着CHO细胞的生长繁殖和代谢的产物表达,对于培养环境中的溶氧情况也是影响CHO 细胞培养效率的重要指标参数。


 

现阶段,CHO细胞培养多采用搅拌式的反应器,在搅拌的过程中实现细胞生长代?#27426;?#27687;气的需求,同时?#34892;?#21435;除多余的二氧化碳(CO2)以实现细胞培养的?#34892;?#36827;行,?#27426;?#36807;大的搅拌速率将会对细胞的培养和表达产物的质量产生?#27426;?#30340;影响。因此,在CHO 细胞培养工?#23637;?#31243;中,搅拌桨的速度要依据CHO细胞的耐受值而进行合理的限定,同时?#34892;?#30340;尺寸要大于细胞的最大?#26412;?#26469;避免细胞受到剪切伤害。因此,CHO细胞培养参数及细胞培养工艺设备的选择都对CHO细胞大规模培养表达单克隆抗体产生较大的影响。


 

 

3
大规模细胞培养工艺对抗体质量的影响

 

作为生物大分子的抗体药物,同?#26412;?#22791;聚体、?#21040;狻?#31958;基化修饰、氧化、?#27687;?#22522;化、异构体、二硫键错配等多种变异?#38382;健?#30001;“细胞工厂”异源表达的重组抗体,其绝大部分质量变异与生产细胞对重组蛋白的翻译后修饰作用直接相关,随着FDA、EMEA对于抗体药物关键质量属性(critical quality attributes)的定义与要求,细胞培养对重组抗体质量的研究?#25214;?#28145;入。
 

 

大规模细胞培养工艺的监测

 

如上述可见,在整个大规模细胞培养过程中对每种参数的监测和代谢物的测定对工艺的监控都至关重要。首先应保证工艺培养前后细胞活性、产物收率、产物质量等主要技术指标维持不变。培养工艺的一致性原则多采取: 非体积依赖参数保持不变(温度、DO、pH 等) ,体积依赖参数( 工作体积、流加体积、通气量)线性放大。反应器的放大至生产规模(>1000L),反应器的选型应充分考虑,混匀时间(mixing time)、溶氧供应和二氧化碳的去除等因素是否满足培养工艺的要求。与之相关的搅拌转速设定和搅拌桨几何尺寸的设计最为复杂。前者多根?#33660;?#20307;积输入功率、搅拌桨线速度、搅拌桨剪切速率、总循环时间、混匀时间等计算得出。


 

近年,FDA 推行“质量源于设计”(quality by design,QbD)的理念,其核心是充分认?#23545;?#26448;料及生产工艺对产品的关键质量属性(critical quality attributes,CQAs)造成的影响,以及CQAs 与临床疗效之间的关系。根据这一要求,产业化阶段需要对细胞培养工艺进行充分的定性研究。此项工作多使用“规模缩小”(scale down)模型,采用“失效模式与影响分析”(failure mode and effects analysis)的方法,对诸多工艺参数( 接种量、培养温度、pH、DO 等) 进行风险排序,确定关键工艺参数及操作?#27573;А?/p>


 

此外,细胞培养工?#31456;?#36275;药物上市评审要求还需有生产规模的实验数据进行支撑,即所谓的“工艺验证”。FDA 和EMEA 分别要求连续3或5批生产的试验数据,并以此为“生物制品许可申请”文件的重要内容。


 

在关键参数的测定中力求数据准确稳定可追溯,能够符合GLP及GMP要求。例如在细胞计数及活率测定上往往?#36824;?#20934;确,操作对实验结果影响比较大,数据波动大,误差大。在此项检测中,贝克曼库尔特的Vi-CELL XR全自动生物图像细胞活力分析系统能够建立统一的、标准的测定方法,更好地解决了细胞计数及活率测定的误差,令细胞培养的研?#25239;?#20316;步入全自动、标准化分析阶段。Vi-CELL XR以其高效及精确的分析,帮助全球的细胞研?#25239;?#20316;者建立起一个标准化的细胞实验室分析平台,提供完整的细胞生物信息。

 

随着培养技术的发展与应用,目前的细胞培养工艺开发,已经从简单的工艺参数优化,进入系统的研究深度,生产细胞的代谢网络与重组抗体合成机制?#25214;?#28165;晰。对于生产细胞系在不同工艺条件下抗体产量的差异,已经能够从基因组、蛋白组、代谢组等不同层次进行分析、解释。这就为今后大规模细胞培养工艺开发提供了新的线索。同时,?#30340;?#38543;着“QbD”理念的深入,越来越多的“过程分析技术”(process analytical technologies)开始应用于细胞培养过程,旨在通过加?#25239;?#38190;过程参数的监控来?#32321;?#34507;白药物的最终质量,如:培养基检测、培养过程监控、多批次数据分析等。未来基于重组抗体表达的细胞大规模培养工艺开发,将朝着稳定产能,提高质量的方向发展。


 


 


 

关键词:Vi-CELL  XR全自动生物图像细胞活力分析系统  

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